Tìm hiểu bệnh uốn ván và vacxin phòng uốn ván

Trực khuẩn uốn ván

Uốn ván là một bệnh nhiễm trùng cấp tính có tỷ lệ tử vong cao do ngoại độc tố của trực khuẩn uốn ván ( Clostridium tetani ) gây ra.

1. BỆNH UỐN VÁN LÀ GÌ ?

Uốn ván là một bệnh nhiễm trùng cấp tính có tỷ lệ tử vong cao do ngoại độc tố của trực khuẩn uốn ván ( Clostridium tetani ) gây ra. Trực khuẩn này phát triển tại vết thương trong điều kiện yếm khí, sau đó giải phóng ngoại độc tố vào máu và tấn công vào các bản vận động thần kinh – cơ, làm cho bệnh nhân bị co cứng cơ và trên nền cứng đó xuất hiện các cơn co giật.

Thời kỳ ủ bệnh khoảng 4 – 21 ngày. Tử vong do suy hô hấp, rối loạn thần kinh thực vật và ngừng tim.

 2. AI CÓ NGUY CƠ MẮC BỆNH UỐN VÁN ?

 Không loại trừ bất kỳ người nào dù là trẻ em, người lớn, người già yếu, nam hay nữ

 3. BỆNH UỐN VÁN CÓ THỂ LÂY LAN NHƯ THẾ NÀO ?

 Vi khuẩn nhất là bào tử uốn ván có khắp nơi trong đất cát , bụi, phân trâu bò ngựa và gia cầm, cống rãnh, dụng cụ phẫu thuật không tiệt trùng kỹ …, xâm nhập vào các vết thương, vết xây xước phát triển thành ổ nhiễm trùng  gây bệnh uốn ván.

 4. BỆNH UỐN VÁN GÂY NGUY HIỂM NHƯ THẾ NÀO ?

 Khi mắc bệnh uốn ván tỷ lệ tử vong rất cao 25 – 90% . Đặc biệt là uốn ván rốn ở trẻ sơ sinh, tử vong trên 95%.

 5. CÓ THỂ PHÒNG NGỪA BỆNH UỐN VÁN ĐƯỢC KHÔNG ?

 Tất cả mọi người đều có thể phòng ngừa được bệnh uốn ván bằng cách tiêm phòng Vacxin uốn ván ( TT ). Đây là phương pháp phòng chống bệnh hiệu quả và rẻ tiền nhất.

 6. ĐỐI TƯỢNG  NÀO CÓ THỂ TIÊM NGỪA VÀ CẦN TIÊM BAO NHIÊU LIỀU ĐỂ PHÒNG NGỪA BỆNH ?

 Vacxin uốn ván được tiêm dự phòng cho các đối tượng sau :

   6.1.  Phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ ( 15 – 44 tuổi ) :

Sau 5  liều tiêm sẽ có kháng thể phòng bệnh uốn ván suốt thời kỳ sinh đẻ.

Hiệu lực bảo vệ đạt 98 – 100%.

  6.2.  Phụ nữ mang thai :

Chỉ cần tiêm hai liều là bảo vệ cho con mình khỏi bị mắc bệnh uốn ván sơ sinh.

  6.3.  Những người có nguy cơ mắc cao :

-       Người làm vườn

-       Người làm việc ở các trang trại, các nông trường chăn nuôi gia súc và gia cầm

-       Người dọn vệ sinh cống rãnh, chuồng trại.

-       Công nhân xây dựng các công trình.

-       Bộ đội và thanh niên xung phong.

Đối tượng này được tiêm miễn dịch 03 liều trong vòng 6 tháng, bảo vệ được 5 năm.

Cứ sau 5 – 10 năm tiêm nhắc lại 01 liều sẽ bảo vệ phòng bệnh uốn ván suốt đời.

  6.4.  Các trường hợp khác :

Người bị vết thương :

-       Nếu đã tiêm miễn dịch cơ bản đầy đủ hoặc đã được tiêm liều nhắc lại trong 5 năm thì không cần tiêm nữa.

-       Nếu đã quá 5 năm và nghi ngờ bị uốn ván thì tiêm ngay 0,5ml vacxin.

-       Nếu tiền sử không rõ thì tiêm 1500IU huyết thanh kháng uốn ván và 0,5ml vacxin bằng 02 ( hai ) bơm tiêm ở hai vị trí khác nhau. Hai tuần sau tiêm nhắc lại một liều vacxin 0,5ml và một tháng sau tiêm liều thứ ba với 0,5ml.

 7. VACXIN PHÒNG NGỪA CÓ GÂY TÁC DỤNG PHỤ GÌ KHÔNG ?

 -       Các phản ứng phụ thường nhẹ và khu trú tại nơi tiêm .

-       Có thể xuất hiện quầng đỏ, sưng đau tại chỗ tiêm, sốt 38 – 39oC. Các triệu chứng nói chung là nhẹ và tự mất đi

-       Đôi khi thấy nổi hạch ở nơi tiêm, nhưng rất hiếm gặp. Hiện tượng thâm nhiễm có thể giảm khi dùng băng ép lạnh.

 CÁC VACXIN CÓ CHỨA THÀNH PHẦN UỐN VÁN :

 1.    VACXIN BẠCH HẦU - UỐN VÁN - HO GA, HẤP PHỤ ( Viết tắt DTP hoặc DTC ) :

 -       Vacxin này phòng ba bệnh : Uốn ván, Bạch hầu, Ho gà nhưng chỉ dùng cho trẻ em dưới năm tuổi.

-       Lưu ý : vì Vacxin này có thành phần Ho gà toàn thân tế bào nên không dùng cho trẻ trên năm tuổi, do có những phản ứng phụ không mong muốn xảy ra.

 2.    VACXIN BẠCH HẦU - UỐN VÁN - HO GÀ TINH CHẾ,  HẤP PHỤ (Viết tắt DTaP) :

 -       Vacxin này phòng ba bệnh : Bạch hầu - Ho gà - Uốn ván cho trẻ em dưới năm tuổi.

-       Do thành phần Ho gà được tinh chế, nên hiện nay Mỹ cho phép dùng để tiêm nhắc lại cho trẻ em 5 - 6 tuổi.

 3.    VACXIN BẠCH HẦU - UỐN VÁN, HẤP PHU ( Viết tắt DT ) :

 -       Vacxin này phòng hai bệnh Bạch hầu và Uốn ván .

-       Thường dùng Vacxin này tiêm cho trẻ em dưới sáu tuổi ở một số nước tiêm Vacxin Ho gà riêng, không phối hợp với nhau thành Vacxin DTP.

-       Trường hợp trẻ em có tiền sử dị ứng với thành phần Ho gà trong Vacxin DTP thì mũi tiêm lần 2, 3 và nhắc lại thay thế bằng vacxin DT.

 4.    VACXIN BẠCH HẦU - UỐN VÁN GIẢM LIỀU, HẤP PHỤ ( Viết tắt Td ) :

 -       Vacxin này phòng bệnh Bạch hầu và Uốn ván cho trẻ lớn : 6 - 16 tuổi.

-       Ưu việt của Vacxin này là đã giảm liều kháng nguyên nên sử dụng được cho trẻ em lứa tuổi lớn.

 5.    VACXIN UỐN VÁN HẤP PHỤ ( Viết tắt TT ) :

 -       Đây là Vacxin đơn giá chỉ phòng duy nhất một bệnh uốn ván.

-       Vacxin này dùng để phòng bệnh Uốn ván cho người lớn, phụ nữ có thai, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ, người lớn có nguy cơ cao.

-       Ở Việt Nam ( tại Viện Vacxin Nha Trang, 09 Pasteur - Nha Trang ), đã sản xuất thành công Vacxin Uốn ván từ năm 1990 đến nay và chế tạo thành hai loại:

                                    .  Vacxin DTP

                                    .  Vacxin TT

cung cấp cho chương trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia. Hiện nay, Viện đang nghiên cứu và tiến tới trình Bộ Y tế cho ra đời Vacxin Td và Vacxin DT nhằm hy vọng đáp ứng linh hoạt hơn về nhu cầu sử dụng.

VI KHUẨN UỐN VÁN :

  Bệnh uốn ván được mô tả từ rất cổ xưa vào thời Hyppocrates nhưng mãi đến năm 1884, Carle và Rattonet mới gây được bệnh uốn ván thực nghiệm bằng cách tiêm dịch nghiền ở vết thương tấy mủ của người mắc bệnh uốn ván cho súc vật thí nghiệm. Họ đã chứng minh tính chất nhiễm khuẩn và mô tả được bệnh uốn ván điển hình ở thỏ ( 1 ).

            Năm 1984, Simpson khám phá rằng triệu chứng bệnh uốn ván rất giống những trường hợp ngộ độc Strychnine.

            Năm 1885, Nicolaier thấy rằng khi ủ đất cát bẩn cho chuột nhắt và các súc vật khác thì chúng thường mắc bệnh có triệu chứng giống như bệnh uốn ván ở người. Ông đã tìm thấy một loại trực khuẩn dài ở tại vết thương tấy mủ nơi mà trước đây đã ủ đất cát bẩn nhưng ông không nuôi cấy được thành chủng thuần khiết. Ông cho rằng triệu chứng sinh bệnh học bệnh uốn ván là do một chất độc giống như Strychnine của trực khuẩn này tiết ra ( 25 ).

            Năm 1889, Kitasato đã phân lập được trực khuẩn uốn ván từ một vết thương tấy mủ, ông đã thuần khiết được trực khuẩn trong môi trường nuôi cấy và nhận thấy canh khuẩn thuần khiết này chứa một loại độc tố hòa tan, độc tố này gây nên triệu chứng bệnh uốn ván ( 1 ).

            Trực khuẩn uốn ván thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridium. Tên khoa học của trực khuẩn uốn ván là Clostridium tetani, là loại trực khuẩn kỵ khí bắt buộc. Hình thái trực khuẩn uốn ván mảnh, hơi cong, khi mới nuôi cấy trên môi trường đặc thì sinh ra những hình thể dài như sợi chỉ, bắt màu Gr (+). Trực khuẩn uốn ván có lông, di động mạnh trong môi trường kỵ khí ( nhưng có chủng không lông ). Gặp điều kiện không thuận lợi thì vi khuẩn sinh nha bào. Nha bào to hơn thân và nằm ở một đầu nên vi khuẩn giống như đinh ghim. Việc hình thành nha bào nhanh hay chậm phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ (2). Sự hình thành nha bào sẽ tăng lên trong điều kiện canh thang có huyết thanh và không có glucoza. Trực khuẩn uốn ván lên men đường glucoza ( 15 ).

 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH :

             Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm độc thần kinh trung ương bởi độc tố của trực khuẩn Clostridium tetani. Trực khuẩn này thường tồn tại trong đất , cát, bụi bẩn thậm chí ngay cả trong ruột già của người và động vật. Phạm vi phân bố đã rộng mặt khác lại là vi khuẩn sinh nha bào nên khả năng tồn tại trong thiên nhiên rất lâu dài và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường vết thương ở chân tay nên tỷ lệ mắc bệnh và chết do trực khuẩn uốn ván khá cao (12).

            Trực khuẩn uốn ván có khả năng gây bệnh cho người và một số động vật nhỏ như : chuột lang, chuột nhắt, thỏ ..., ngoài ra bò, cừu, chó, mèo cũng có thể bị bệnh uốn ván. Ở người trực khuẩn uốn ván vào cơ thể qua vết thương nhỏ hay lớn ( có khi nhỏ quá không chú ý ) ( 2 ), ở trẻ sơ sinh do vết cắt rốn ( dụng cụ cắt rốn có mang nha bào uốn ván tiệt trùng không kỹ ) (1).

            Một thế kỷ qua kể từ ngày tìm ra trực khuẩn uốn ván nhưng bệnh uốn ván vẫn còn là vấn đề cần được quan tâm vì tỷ lệ tử vong cao, nhất là trẻ sơ sinh. Theo thông báo dịch quí II năm 1993, trẻ sơ sinh bị bệnh uốn ván là 36,4% còn các lứa tuổi khác 15,1%.

            Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh và độc tố này xâm nhập vào các  phần khác trên cơ thể. Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, trực khuẩn bị phá hủy bởi acide dạ dày do đó không gây bệnh theo đường tiêu hóa  (18).

 TÍNH CHẤT SINH HÓA CỦA ĐỘC TỐ UỐN VÁN :

             Tác nhân dẫn đến tử vong chính là độc tố uốn ván. Độc tố uốn ván là độc tố vi khuẩn thứ hai được phát hiện ( đầu tiên là độc tố Bạch hầu ). Độc tố uốn ván có tính độc rất mạnh, liều gây chết ở người 2,5ng/kg cân nặng. Độc tố uốn ván được tổng hợp trong tế bào vi khuẩn uốn ván,  là chuỗi polypeptide đơn có trọng lượng phân tử 150.000 dalton. Trong các điều kiện nuôi cấy thí nghiệm, độc tố tách từ  nước nổi của canh khuẩn gồm hai chuỗi polypeptide : chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, chúng liên kết với nhau bằng cầu nối disunfic ( -S-S- ) (23). Độc tố này tan trong nước, bị phá hủy khi đun nóng ở nhiệt độ 70oC (1).

            Sinh lý của trực khuẩn uốn ván trong việc sản sinh ra độc tố cũng chưa biết rõ. Độc tố uốn ván không có ích cho vi khuẩn, nó không phá hủy bất cứ cấu trúc tổ chức  nào để giúp vi khuẩn xâm nhập vào mô của động vật. Hoạt tính của độc tố rõ ràng được gắn với mô thần kinh, một mô mà vi khuẩn dường như không đến trực tiếp trong quá trình nhiễm trùng của động vật . Thật khó mà có thể tin được, vi khuẩn sinh ra một hợp chất như là một protein chiếm tới 5 - 10% trọng lượng tế bào mà không có vai trò nào đối với vi khuẩn uốn ván (25 ).

            Những nghiên cứu về mặt hóa học của độc tố uốn ván cho  thấy độc tố gồm hai thành phần :

            1 . Một phần có tác dụng gây tan máu, gọi là tetanolysin, không có ý nghĩa về lâm sàng.

            2 . Một phần gây co giật các cơ, gọi là tetanospasmin. Các triệu chứng cơ bản của bệnh uốn ván như cứng hàm, lưng uốn cong, co giật đau đớn là do tetanospasmin gây ra. Chất độc này đi từ vết thương có trực khuẩn, qua máu hoặc bạch huyết vào các đầu mút dây thần kinh ngoại vi rồi bám vào trung tâm thần kinh gây ra triệu chứng uốn ván (1) (3).

            Bản chất của độc tố uốn ván là một protêin đơn giản chứa 15,7% Nitơ, 0,062% Phospho, 1,04% Sulfur. Nó không chứa Carbonhydrat và không chứa Lipide. Điểm pH đẳng điện của độc tố uốn ván là 5 - 5,2. Độc tố bắt đầu bị kết tủa trong dung dịch và mất hoạt tính khi pH <6, nhưng nó bền ở pH = 5 khi có mặt glycine (25).

            Thành phần acide amin trong cấu trúc phân tử độc tố uốn ván với trọng lượng phân tử 150.000 dalton đã được một số tác giả nghiên cứu ở bảng 1 (16).

            Mặc dù vậy, năm 1948, Pillemer và Moore đưa ra một trọng lượng phân tử  của độc tố uốn ván từ  66.000 - 74.000 dalton. Nhưng trong thực tế, có những dạng độc tố uốn ván có trọng lượng phân tử lớn hơn, trung bình 140.000 dalton (25).

            Về cấu trúc phân tử độc tố uốn ván, một số tác giả đưa ra số nhóm SH tự do, số cầu nối S - S ở bảng 2 (16).

            Bảng 1: So sánh thành phần acide amin của độc tố uốn ván ( Số lượng acide amin trong 1 mol độc tố uốn ván, trọng lượng phân tử 150.000 dalton ).

Bảng 2 : Số lượng và hoạt tính các nhóm SH, số lượng cầu nối S - S trong độc tố uốn ván theo các tác giả nghiên cứu khác nhau:

MIỄN DỊCH PHÒNG UỐN VÁN :

 1. Miễn dịch tự nhiên :

            Kể từ lúc tìm ra nguyên nhân gây bệnh uốn ván đến nay, có một số tác giả quan tâm nghiên cứu loại miễn dịch này thật sự có hay không đối với bệnh uốn ván. Song đến nay ( 1993 ), Tổ chức Y tế thế giới đã đúc kết và chính thức nhận định loại miễn dịch này hầu như không có và nếu hạn hữu có thì cũng không đủ lượng kháng thể phòng bệnh uốn ván (22).

 2. Miễn dịch chủ động nhân tạo :

            Đưa vacxin vào cơ thể để gây miễn dịch tạo kháng thể chống lại bệnh uốn ván là phương pháp gây miễn dịch chủ động có hiệu lực nhất phòng bệnh uốn ván.

            Năm 1974, TCYTTG đưa ra chương trình tiêm chủng mở rộng phòng 6 bệnh truyền nhiễm cho trẻ em trong đó có bệnh uốn ván (22).

            Từ năm 1987, chương trình tiêm chủng mở rộng toàn cầu khuyến cáo rằng dùng vacxin TT tiêm cho phụ nữ ở lứa tuổi sinh đẻ để tiến tới loại trừ uốn ván sơ sinh (22).

3. Miễn dịch thụ động :

            Behring là người đặt nền móng cho loại miễn dịch thụ động phòng uốn ván. Tại hội nghị " Deusch medizinische Wochenshrift" tổ chức ngày 4/10/1890, Von Behring và Kitasato (1890) đã loan báo rằng huyết thanh của thỏ và chuột nhắt có miễn dịch chống uốn ván, chính xác hơn là chống tính độc của độc tố tiết ra từ trực khuẩn uốn ván. Huyết thanh này giữ nguyên đặc tính khi lấy huyết thanh của súc vật có miễn dịch truyền sang súc vật chưa được miễn dịch.

            Ngày nay, người ta dùng huyết thanh kháng độc tố uốn ván sản xuất từ huyết thanh ngựa đã gây miễn dịch bằng GĐTUV để phòng bệnh uốn ván ( trong thời gian ngắn cần ngay một lượng lớn kháng thể đủ khả năng chống uốn ván )

 SẢN XUẤT VACXIN :

             Ngay sau khi phân lập và nuôi cấy được vi khuẩn uốn ván. Năm 1890, Behring và Kitasato đã chứng minh rằng : độc tố uốn ván có tính kháng nguyên tốt, tạo được đáp ứng miễn dịch phòng bệnh uốn ván. Thời gian này họ đã điều chế được huyết thanh kháng độc tố uốn ván ở súc vật dùng điều trị và phòng bệnh uốn ván.

            Năm 1924, Descombey là người đầu tiên dùng formalin khử độc độc tố uốn ván, đặt nền móng cho việc sản xuất giải độc tố uốn ván làm vacxin phòng uốn ván (17).

            Quá trình điều chế vacxin uốn ván, việc đầu tiên là phát triển phương pháp nuôi cấy vi khuẩn uốn ván lấy độc tố, từ độc tố mới tiếp tục các bước tiếp theo như khử tính độc, tinh chế, hấp phụ kháng nguyên vào tá chất thích hợp tạo thành vacxin đơn giá hoặc phối hợp với nhiều vacxin khác.

            Từ 1944 đến những năm 1960, việc sản xuất độc tố uốn ván chủ yếu sử dụng phương pháp lên men tĩnh ( Static culture ) hay gọi là phương pháp cổ điển. Người ta nuôi cấy vi khuẩn uốn ván trong các bình thủy tinh miệng rộng với môi trường kỵ khí thích hợp. Các chai nuôi cấy được đặt trong tủ ấm hoặc phòng ấm 36oC - 37oC. Sau thời gian nhất định ( thường 4-5 ngày, có tác giả để 8-14 ngày đến lúc tế bào ly giải ) độc tố giải phóng vào nước nổi môi trường nuôi cấy, thu nhận độc tố bằng các phương pháp lọc.

            Năm 1947, Raynaud đưa ra khái niệm "canh khuẩn non" ( 1-3 ngày nuôi cấy ) là canh khuẩn chủ yếu chứa các tế bào chưa bị ly giải, canh khuẩn như thế hầu hết lượng độc tố nằm trong tế bào.

            Năm 1951, cũng chính Raynaud đề xuất một phương pháp trích chiết độc tố trong tế bào uốn ván bằng cách cưỡng bức ly giải canh khuẩn non. Ông tập trung vi khuẩn bằng cách ly tâm " canh khuẩn non " và giữ chúng trong dung dịch muối ( NaCl 1M + Na2CO3 0,1M ) ở 4oC/4 ngày, sau đó để ở 35oC/2 ngày. Ly tâm lấy nước nổi xác định Lf/ml bằng phản ứng lên bông (22).

            Độc tố thu được theo phương pháp của Raynaud có tác dụng gây miễn dịch trên ngựa tạo kháng thể (22 ).

            Phương pháp này đã được một số phòng thí nghiệm ứng dụng sản xuất độc tố lúc bấy giờ. Thời gian gặt lấy vi khuẩn thường là 72 giờ (22).

            Về sau phương pháp này vừa dùng để xác định độc tố trong tế bào vừa so sánh lượng độc tố có trong nước nổi ( ngoài tế bào ) và dùng để tìm ra thời gian nuôi cấy tối ưu thu nhận được độc tố cao nhất. Năm 1955, ông xác định được lượng độc tố cực đại trong tế bào cũng như ở nước nổi tại thời gian nuôi cấy khác nhau tùy thuộc vào số lần cấy truyền chủng

       Sự thay đổi hàm lượng độc tố uốn ván trong và ngoài tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy uốn ván ở thể tích 500ml, lượng độc tố tổng số bằng tổng độc tố trong và ngoài tế bào.

       Thí nghiệm A : cấy chuyền chủng 9 lần

       Thí nghiệm B : cấy chuyền chủng 66 lần.

 Việc sản sinh độc tố uốn ván không giống như việc sản sinh độc tố bạch hầu. Độc tố bạch hầu được phóng thích vào nước nổi song song với sự sinh trưởng của vi khuẩn, còn sản sinh độc tố uốn ván thì ngược lại. Độc tố uốn ván hình thành rất sớm trong pha phát triển nhưng lưu lại một lượng lớn nằm trong tế bào, một lượng nhỏ phóng thích vào môi trường nuôi cấy. Sản lượng độc tố tối đa phụ thuộc mật thiết vào mối liên quan giữa quá trình sinh trưởng phát triển của vi khuẩn và yếu tố tế bào vi khuẩn tự ly giải ( autolys ). Sản lượng độc tố tối đa là tổng cộng của độc tố nằm trong tế bào và trong nước nổi canh khuẩn.

Từ những năm 1970 trở lại đây cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta đã nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván trên các nồi lên men với các điều kiện kiểm soát được như dùng thiết bị rung tạo cho vi khuẩn phân tán đều trong môi trường lỏng, dùng khí nén thổi qua bề mặt canh cấy để loại khí H2S sinh ra trong quá trình nuôi cấy ( Phương pháp nuôi cấy đồng nhất hay còn gọi là phương pháp nuôi cấy động = homogeneous culture ).

            Sirks ( 1956 ) và Van Hemert (1962) là những người đầu tiên phát triển phương pháp nuôi cấy đồng nhất ( homogeneous ) trên nồi lên men 5 lít bằng thép không rỉ, thu nhận được một lượng độc tố đáng khích lệ. Đầu tiên người ta dùng khí thổi qua bề mặt, khuấy nhẹ để tạo sự phân tán đều của vi khuẩn cùng với sự cân nhắc không để oxy khuếch tán vào môi trường gây ức chế vi khuẩn phát triển.

       Về sau nhiều nghiên cứu tiếp tục phát triển trên các nồi lên men lớn hơn : nồi thủy tinh 50lít, nồi bằng thép không rỉ nhiều kích cỡ tới 1000 lít.

       Năm 1967, Van Wezel so sánh hiệu quả lên men của hai phương pháp trên thấy rằng : với phương pháp nuôi cấy đồng nhất ( homogeneous ) cho hiệu giá Lf/ml gấp đôi phương pháp nuôi cấy tĩnh ( static culture ).

       Bảng 3. ( Van Wezel,1967 )

       Hiệu giá trung bình giải độc tố uốn ván của nhiều loạt nuôi cấy đơn sản xuất tại Viện RIVM theo 2 phương pháp nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy động.

       Các phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván nói chung, đặc biệt khi phát triển phương pháp sản xuất trên qui mô công nghệ sinh học ( nuôi cấy trên nồi lên men), người ta tập trung giải quyết những vấn đề chủ chốt sau đây trong mối liên quan mật thiết.

       1 .Về chủng giống : ngay từ chiến tranh thế giới thứ hai, hầu hết các phòng thí nghiệm, sản xuất độc tố uốn ván trên khắp thế giới ( Mueller và Miller, 1945; Pillimer, et al., 1948; Largier, 1956; C.latham, et al, 1962; Thomson, 1957; Dawson và Mauritzen, 1967; Murphy và Miller, 1967 ) đêu dùng chủng Harvard - 49205 để sản xuất độc tố ( 25 )

       Năm 1965, TCYTTG chính thức khuyến cáo dùng chủng "Harvard train, 49205, code Y " và nhấn mạnh đây là chủng sản sinh độc tố có tính kháng nguyên cao. Ngày nay, hầu hết các nước có sản xuất vacxin uốn ván đều dùng chủng này ( Hà lan, Hungari, Ấn độ, Indonesia, Philipin, Thụy Điển ... ) ( 10,15,27,28 ).

       2. Nuôi cấy vi khuẩn trên nồi lên men bằng thép không rỉ. Phân tán đều vi khuẩn trong môi trường bằng thiết bị rung, không dùng cánh khuấy.

       3. Dùng khí nén thổi qua bề mặt canh khuẩn để loại khí H2S sinh ra trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Năm 1967, Van Wezel đã chứng minh rằng nếu dùng khí Nitơ thay cho khí nén thì mặc dầu vi khuẩn vẫn phát triển tốt song cho độc tố thấp hơn so với dùng khí nén (25).

       4. Môi trường nuôi cấy sản sinh độc tố : môi trường Tarozzi chứa các mảng thịt băm và glyceril là môi trường kỵ khí được dùng sớm nhất và rộng rãi nhất. Hiệu giá đạt 1-3 Lf/ml. Nhiều tác giả tiếp tục phát triển nhiều loại môi trường khác như môi trường Gluzmal, Latham, Prevot và Boorsma ... với kỳ vọng sản xuất được độc tố có hiệu giá cao . Thành công nhất là môi trường Mueller và Miller, năm 1945, cải tiến năm 1947 và 1945. Môi trường Mueller và Miller được ứng dụng có hiệu quả không những cho phương pháp sản xuất cổ điển ( nuôi cấy trên chai thủy tinh ) mà còn có tác dụng  tốt cho đến ngày nay với phương pháp sản xuất bằng công nghệ sinh học ( nuôi cấy trên nồi lên men ). Môi trường này đạt hiệu giá 50 - 90 Lf/ml (25). Năm 1964, nhắc lại năm 1977, TCYTTG chính thức yêu cầu dùng môi trường Mueller và Miller cho sản xuất độc tố uốn ván (20). Thành phần Nz - Case TT trong môi trường Mueller và Miller ảnh hưởng nhiều đến việc sản sinh độc tố uốn ván (25).

       5. Khử độc và tinh chế : kể từ năm 1924 ( lần đầu tiên phát hiện Formalin khử độc độc tố uốn ván ) đến nay, Formalin vẫn là một chất bất hoạt ổn định nhất với độc tố uốn ván. Không những thế mà ngày nay còn sử dụng rộng rãi Formalin khử tính độc của nhiều loại độc tố khác  để điều chế vacxin vi khuẩn cũng như vacxin vi rút (24). Năm 1977, TCYTTG yêu cầu giai đoạn nuôi cấy phải gặt được độc tố có hiệu giá ³ 40Lf/ml mới đạt tiêu chuẩn đưa vào giải độc làm vacxin (10,20,28).

       Năm 1946, Pillemer là người đầu tiên và duy nhất kết tinh được độc tố uốn ván. Phương pháp kết tinh của ông nhằm mục đích đạt được độc tố uốn ván tinh khiết . Ông dùng Methanol 20% tủa độc tố; kiểm soát pH = 6; nồng độ protein 1%; độ dẫn điện của dung dịch độc tố là 0,02; nhiệt độ -5oC. Sự kết tinh xảy ra sau một vài ngày và kết thúc sau vài tuần. Nhiều tác giả tiếp tục phát triển tinh khiết độc tố uốn ván trên ý tưởng và phương pháp của Pillemer như : Largier, 1956 dùng kỹ thuật siêu ly tâm; Dawson và Mauritzen, 1967 tủa độc tố ở - 15oC với Methanol 40% sau đó dùng cột DEAE -cellulose; Murphy và Miller, 1967, Murphy, 1968 dùng (NH4)2SO4 tủa độc tố hai lần với hàm lượng khác nhau, hòa tan tủa bằng dung dịch đệm, pH=7,5, loại muối bằng cột  Sephadex 50, cuối cùng là tiến trình trên cột Sephadex G-100 (25).

       Năm 1964, nhắc lại 1977, TCYTTG khuyến cáo tinh chế giải độc tố thô qua các giai đoạn chính (20) :

-                   Cô đặc và loại bớt tạp chất bằng máy siêu lọc.

-                   Tủa phân đoạn bằng muối (NH4)2SO4, hoàn nguyên bằng dung dịch muối NaCl 0,85%.

-                   Loại (-SO4) bằng máy siêu lọc.

-                   Lọc vô trùng bằng thiết bị lọc thích hợp.

-                   Yêu cầu độ sạch kháng nguyên ³ 1000 Lf/mg protein Nitơ.

       6. Hỗn hợp thành các vacxin : giải độc tố uốn ván tinh chế được dùng để cấu tạo nên vacxin đơn giá như vacxin TT và các vacxin hỗn hợp như vacxin DTP; vacxin DT dùng để tiêm nhắc lại gây miễn dịch cho trẻ em ở trước 6 tuổi; vacxin Td dùng để miễn dịch nhắc lại cho trẻ em lứa tuổi lớn (14).

       Thông thường các vacxin trên được hấp phụ bởi tá chất chứa nhôm ( aluminium phosphate hoặc aluminium hydroxide ) để làm tăng tính công hiệu của kháng nguyên uốn ván. Lượng nhôm trong vacxin DTP và TT £ 1,25 mg Al3+ trong một liều tiêm người ( 1 liều = 0,5ml ) (20).

Khi kháng nguyên phối hợp với tá chất thí tính kháng nguyên cũng tăng lên, làm tăng khả năng sinh kháng thể của kháng nguyên . Vì tá chất có tác dụng giữ kháng nguyên tại chỗ, do đó tạo nên kho cung cấp và duy trì được kháng nguyên ở hàm lượng cao xung quanh vị trí tiêm, đồng thời lan tỏa ra dần dần, dẫn đến sự kích thích của kháng nguyên thường xuyên đối với cơ quan miễn dịch (5). Đại thực bào làm tiêu muối nhôm mang kháng nguyên và do đó tăng khả năng tạo miễn dịch vượt quá xa của bản thân kháng nguyên hòa tan.

       Tại Việt Nam từ năm 1986 trở về trước áp dụng sản xuất vacxin uốn ván theo phương pháp nuôi cấy cổ điển.

       Năm 1986 đến nay, Viện vacxin sản xuất theo phương pháp nuôi cấy trên nồi lên men: chủng sản xuất có nguồn gốc Harvard ( Mỹ ) mang số hiệu 49205; môi trường nuôi cấy lấy độc tố là FMM ( Fisek - Mueller - Miller ) thành phần chính của  môi trường là các acide min từ nguồn Nz -Case TT ( thủy phân từ Cazein ), dung dịch đường glucose + muối NaCl, các vitamin và một số chất khoáng vi lượng. Nuôi cấy vi khuẩn trên nồi lên men 100 lít, thu nhận độc tố, tiến hành giải độc, tinh chế và cuối cùng hỗn hợp thành vacxin DTP và vacxin TT (10).

       Công hiệu vacxin TT ³ 80 đơn vị miễn dịch (IU/ml ). Công hiệu thành phần uốn ván trong vacxin DTP   ³ 120 IU/ml (7,8,9).