Dấu ấn ADN và các xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống, truy tầm tông tích, phát hiện thủ phạm
Tác giả : TS. BS. PHẠM HÙNG VÂN - Giảng viên Bộ môn Vi sinh, khoa Y, Ðại học Y Dược TPHCM
Sau khi đăng bài "Giám định hài cốt liệt sĩ bằng công nghệ ADN" của
tác giả Ban Mai (SK&ÐS số 237 ra ngày 18/72003). Tòa soạn báo nhận
được rất nhiều thư bạn đọc bày tỏ sự quan tâm về vấn đề này, trong
đó có một số độc giả mong muốn có bài viết chuyên sâu hơn về phương
pháp dấu ấn ADN và các xét nghiệm phát hiện quan hệ huyết thống.
Ðể đáp lại sự quan tâm của bạn đọc, SK&ÐS xin trân trọng giới thiệu bài viết của TS. BS. Phạm Hùng Vân, giảng viên Bộ môn Vi sinh, khoa Y, Ðại học Y Dược TPHCM. Qua đó có thể giúp chúng ta hình dung được phần nào cuộc hành trình khó khăn và đầy nhân ái của đội ngũ các nhà khoa học Việt Nam.
Một người da đen (gọi là "X") sinh tại Anh đã bỏ qua sống với cha của mình tại Ghana. Sau đó anh ta xin qua trở lại Anh để sống với mẹ (gọi là "M") và ba người anh chị em ruột của mình thì bị từ chối cho nhập cảnh vì người ta nghi ngờ đã bị thay thế bởi một người cháu hay một người không thân thuộc gì với bà mẹ. Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xảy ra vào năm 1985, lúc này xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) đã được thực hiện và xác định được bà mẹ có liên hệ với "X?", tuy nhiên không thể loại trừ được M là cô hay dì của "X?". Thắc mắc trên tưởng chừng bế tắc, không có cách giải quyết, nhưng may mắn Jeffereys và các cộng sự đã được nhờ đến và lần đầu tiên xét nghiệm dấu ấn ADN được áp dụng trong trường hợp này. Kết quả xét nghiệm đã xác định được đúng "X?" chính là "X" vì "X?" có mang các dấu ấn ADN từ M, đồng thời có chung các dấu ấn ADN với những đứa con của "M" thừa hưởng từ người cha.
Vậy dấu ấn ADN là gì? Nguyên tắc hoạt động của các xét nghiệm dấu ấn ADN như thế nào? Những tiến bộ và các phạm vi ứng dụng hiện nay của xét nghiệm dấu ấn ADN ra sao?
ADN bộ gen người của chúng ta có đến 30% chứa các trình tự base lặp lại và hầu như không mang những mã có ý nghĩa chức năng. Cũng như các trình tự base có ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ cha mẹ sang con cái theo định luật phân ly độc lập của Mendel. Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, có nhiều trình tự base lặp lại có thể giúp phân biệt được cá nhân này với các nhân khác, không những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau hay không? Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu ấn ADN. Có hai loại dấu ấn ADN hiện đang được dùng trong xét nghiệm dấu ấn ADN là:
Các tiểu vệ tinh (minisa-tellite)
Ðó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi các trình tự base lặp lại), có các kích thước thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB). Các VNTRs này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đa vị trí (multilocus minisatellite); Hay chỉ có tại một vị trí trên bộ gen, là tiểu vệ tinh đơn vị trí (single-locus minisatelite). Xét nghiệm dấu ấn ADN mà Jeffereys thực hiện năm 1985 là xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí bằng kỹ thuật phát hiện sự đa hình về chiều dài các đoạn ADN của bộ gen bị cắt bởi men cắt hạn chế (Restriction Fragments Lenght Polymorphism = RFLP). Kỹ thuật này được tóm tắt như sau (hình 1): (1) Trước hết mẫu máu được lấy từ những người cần thử nghiệm để tách được bạch cầu, sau đó ly trích toàn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các mẫu thử nghiệm; (2) Cắt đoạn các bộ gen đã ly trích này bằng men cắt hạn chế, là một loại men cắt nhận diện được 4 trình tự base đặc hiệu, nhờ đó cắt đoạn được bộ gen thành những mảnh ADN dài ngắn khác nhau, trong đó có những mảnh chứa các trình tự base lặp lại; (3) Ðiện di mẫu thử nghiệm để phân tách các đoạn ADN này trên thạch agarose, sau đó chuyển các đoạn ADN trên thạch này qua một màng nylon bằng kỹ thuật thấm Southern (Southern blotting); (4) phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng cách lai với một trong những dò ADN đánh dấu đồng vị phóng xạ và đặc hiệu cho các trình tự base lặp lại này. Trong thử nghiệm, Jeffereys đã thiết kế 2 dò ADN có mã số là 33.6 và 33.15. Kết quả xét nghiệm ở trường hợp trên đã cho thấy "X?" có 61 vị trí của trình tự lặp lại đặc hiệu với hai loại dò 33.6 và 33.15, và tất cả 61 vị trí này đều thấy hiện diện được trên M (do "X?" đã di truyền được từ "M") hoặc trên 3 người con của "M" (do "X?" và họ đã di truyền được từ cha mình, tức là chồng của "M" dù không có mẫu thử nghiệm lấy từ ông này).
Xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí, vì dùng kỹ thuật RFLP, nên được gọi ngắn gọn là xét nghiệm RFLP. Xét nghiệm này được dùng khá nhiều trong xác định quan hệ huyết thống. Xin dẫn thêm một trường hợp bị chứng minh loạn luân tại Anh (ảnh 1). Kết quả xét nghiệm RFLP cho thấy mẹ đứa bé là "D" và cha của nó là "F" có đến 62% các vạch vị trí của tiểu vệ tinh đa vị trí trùng nhau; đồng thời "F" và "B" lại có đến 78% các vạch trùng nhau. Chính nhờ vậy mà đã xác định được chẳng những "F" là cha của "D" đồng thời cũng là cha của "B", có nghĩa là "F" vừa là ông ngoại, vừa là cha của "D". Tuy nhiên xét nghiệm RFLP có một hạn chế là phải có mẫu thử nhiều tế bào để có thể trích được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới 10ml máu để tách đủ bạch cầu dùng trong ly trích bộ gen).
Nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí cũng rất có giá trị là dấu ấn ADN đã được phát hiện, ví dụ tiểu vệ tinh kết hợp với vị trí của gen globulin nằm trên nhiễm sắc thể 16 (gọi là 3’ a HVR) hay kết hợp với vị trí của gen Globulin miễn dịch chuỗi nặng nằm trên nhiễm sắc thể 14... Tuy nhiên vì chỉ có một vị trí trên bộ gen nên sau khi bộ gen bị cắt bởi men cắt hạn chế, điện di, thấm Southern và phát hiện bằng dò ADN đặc hiệu cho trình tự base lặp lại, trên màng nylon chỉ có thể xuất hiện 3 loại kiểu hình vị trí phản ảnh kích thước đoạn ADN chứa trình tự base lặp lại: ngắn-ngắn, dài-dài, ngắn-dài (ảnh 2). Hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm tư nhân và chính phủ thực hiện xét nghiệm dấu ấn ADN này. Các phòng xét nghiệm dùng một bộ xét nghiệm phát hiện không chỉ một loại tiểu vệ tinh đơn vị trí mà phát hiện 4 đến 6 loại tiểu vệ tinh đơn vị trí cùng một lúc, chính nhờ vậy mà kết hợp kết quả các vị trí vạch trên màng nylon dư sức đa hình để phân biệt được sự khác nhau của các mẫu thử nghiệm với xác suất giống nhau giữa hai cá nhân rất thấp đến mức hầu như khó có thể xảy ra. Xét nghiệm này có ưu thế hơn xét nghiệm RFLP vì kết quả đa hình cao nhờ sự kết hợp phát hiện nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí cùng một lúc. Ngoài ra, xét nghiệm còn có thể thực hiện trên các mẫu không cần có sự nguyên vẹn của bộ gen. Trong nhiều trường hợp, vẫn có thể làm được xét nghiệm trên các mẫu thử chứa ít ADN nhờ phương pháp khuếch đại tín hiệu phát hiện các vạch đặc hiệu trên màng nylon bằng cách dùng các dò ADN đặc hiệu VNTRs để lai cặp, rồi sau đó tái lai cặp bằng các dò ADN phụ trợ. Nhờ những ưu thế này mà xét nghiệm phát hiện các tiểu vệ tinh đơn vị trí ngoài việc dùng xác định quan hệ huyết thống, còn có thể sử dụng trong những mục đích pháp y khác mà chúng tôi sẽ đề cập ở phần sau. Tuy nhiên, xét nghiệm này cũng có nhược điểm là không thể thực hiện trên các mẫu có quá ít ADN, hay khi mẫu bị lẫn nhiều mảnh ADN nhỏ do mẫu thử bị phân hủy vì những mảnh ADN này có thể làm đứt đoạn các VTNR trong các tiểu vệ tinh.
Các vi vệ tinh (micro satellite)
(Xem tiếp kỳ sau)
